Как процедурите по витрификация се развиваха във времето

Витрификацията не е едно изобретение. Тя се развива постепенно, докато изследователите решават различни проблеми, свързани с клетки, ембриони, органи и в крайна сметка с биостазата при хора.

Целта звучи просто: водонаситена тъкан се охлажда до стъкловидно състояние, без да се образува увреждащ лед.

Постигането на тази цел обаче е трудно. Криопротектантите могат да бъдат токсични. Въвеждането им в тъканта може да предизвика деформация на клетките. Големите обекти се охлаждат неравномерно, натрупват напрежения и се затопляват обратно много по-трудно.

Затова съвременните процедури са системи, а не рецепти. Тяхното качество зависи от съвместното действие на химията, перфузията, температурата, времето, геометрията и измерването.

Преди витрификацията: студът причинявал втора травма

В ранните етапи криосъхранението в повечето случаи се свеждало до замразяване. Охлаждането забавяло химичните процеси, но водата кристализирала в лед.

Ледът изтласква солите и другите разтворени вещества в останалата течност. В резултат клетките могат едновременно да бъдат подложени на механични увреждания, много високи концентрации на разтворени вещества, обезводняване и увреждане на мембраните.

По-бързото охлаждане може да направи кристалите по-малки, но обикновената вода се нуждае от изключително висока скорост на охлаждане, за да премине в стъкловидно състояние без химична помощ. Това работи само при изключително тънки образци.

Историческият проблем не бил само достигането на ниска температура. Проблемът бил как да се достигне тази температура, без водата да образува увреждащи кристали.

1937 до 1938 година: първите опити с кинетична витрификация

Базил Люйе предложил витрификацията като стратегия за биологично съхранение през 1937 година.

През 1938 година Люйе и Юджийн Ходап съобщили за възстановена подвижност при сперматозоиди на жаба, изложени на течен въздух след обезводняване с концентрирана захароза.

В първоначалния експеримент били използвани микроскопични филми и извънредно висока скорост на охлаждане. Експериментът показал, че това е физически възможно, но не предложил приложим протокол за съхраняване на орган.

Този подход днес се нарича кинетична витрификация: кристализацията се предотвратява чрез отвеждане на топлината по-бързо, отколкото ледът може да се зароди и да нарасне.

При по-големи обекти този подход губи своята ефективност. Повърхността нараства по-бавно от обема, така че центърът на голям образец не може да следва повърхността достатъчно бързо.

1949 година: глицеролът променя проблема

Кристофър Полдж, Одри Смит и Алан Паркс открили през 1949 година, че глицеролът може да защити сперматозоидите при съхранение при ниска температура.

Тяхната публикация в Nature показала практическото значение на проникващите криопротектанти.

Тези молекули проникват в клетките, взаимодействат с водата и намаляват количеството лед, което се образува при дадена температура. Освен това намаляват увреждащата концентрация на разтворени вещества по време на замразяването.

Откритието преобразило криобиологията, защото скоростта на охлаждане вече не била единствената контролируема променлива. Химичният състав можел да промени фазовото поведение на водата.

Откритието поставило и нова задача за оптимизиране на протоколите. По-голямо количество криопротектант потиска леда по-ефективно, но увеличава химичното и осмотичното увреждане.

1959 до 1968 година: повече агенти и поетапно натоварване

През 1959 година Джеймс Лъвлок и Маркус Бишъп съобщили, че диметилсулфоксидът защитава няколко вида клетки от увреждане при замразяване.

DMSO прониквал през някои клетъчни мембрани по-лесно от глицерола. Това разширило кръга от клетки, които могат да бъдат защитени при криосъхранение, а DMSO и днес се използва широко в лабораторната и клиничната практика.

По-късно Джон Фарант изследвал постепенното повишаване на концентрацията на криопротектанта при едновременно понижаване на температурата, като тъканта се поддържала в концентриран разтвор без преднамерено образуване на лед.

Това предвещавало основен принцип на съвременните протоколи: криопротектантът се въвежда постепенно при ниска температура, вместо тъканта да бъде изложена наведнъж на пълната концентрация при по-висока температура.

Поетапното натоварване ограничава осмотичния шок. По-ниската температура намалява скоростта на много химични реакции и може да направи иначе увреждащото излагане по-поносимо.

През 1968 година опити показали, че червените кръвни клетки могат да достигнат температурата на течния азот без видим лед при достатъчно висока концентрация на глицерол.

Основните принципи вече били формулирани. Липсвал обаче практически метод за прилагането им при сложна васкуларизирана тъкан.

1984 година: витрификацията се превръща в стратегия за органи

Публикацията от 1984 година „Витрификация като подход към криосъхранението“ представила витрификацията като сериозен подход към съхраняването на органи в биобанки.

Тази стратегия понякога била наричана равновесна витрификация. Вместо да се разчита на непостижимо висока скорост на охлаждане, се използва достатъчно криопротектант, така че необходимата скорост на охлаждане да стане постижима и при по-голяма система.

Този подход очертал три взаимосвързани ограничения:

• Разтворът трябва да устоява на леда при постижими скорости на охлаждане и затопляне.
• Органът трябва да понесе въвеждането и последващото отстраняване на този разтвор.
• Преди началото на охлаждането криопротектантът трябва да достигне до всички части на органа.

Дадена формулация може да даде отлични резултати в епруветка, но да се окаже неефективна при орган, тъй като съдовото съпротивление, дифузионните разстояния и токсичността влияят върху резултата.

1985 година: живи ембриони се възстановяват от стъкловидно състояние

Уилям Рол и Грегъри Фахи съобщили за безледово криосъхранение на мишите ембриони при минус 196 °C през 1985 година.

Това било решаваща биологична демонстрация. Живи клетки с ядро от бозайници можели да преживеят охлаждане и затопляне след преминаване през напълно витрифицирано състояние.

Ембрионите обаче остават крайно малки. Тяхната температура и концентрация могат да се променят бързо и равномерно в сравнение с орган на възрастен организъм.

Резултатът потвърдил принципа на метода, но същевременно подчертал проблема с мащаба.

Проблемът с мащаба се разпада на четири проблема

1. Токсичност на криопротектанта

Концентрацията, необходима за витрификация, може да нарушава протеини, мембрани и клетъчния метаболизъм. Токсичността зависи от агента, концентрацията, температурата, времето на излагане и вида тъкан.

Това означава, че определението „по-малко токсичен“ не се отнася само до свойствата на една молекула. То зависи от целия протокол за въвеждане и отстраняване на криопротектанта.

2. Осмотичен стрес

Добавянето на концентриран разтвор изтегля вода извън клетките. Отстраняването му може да върне водата обратно твърде бързо.

Съвременните протоколи използват постепенно повишаване на концентрацията, буферни разтвори, температурен контрол и непроникващи разтворени вещества, за да поддържат промените в клетъчния обем в поносими граници.

3. Неравномерно доставяне

Органът не е контейнер с еднородна течност. Криопротектантът се пренася по съдовете, преминава през капилярните стени и след това се разпространява в тъканта чрез дифузия.

Съсиреци, отоци, съдови заболявания, исхемия и кръвно-мозъчната бариера могат да доведат до концентрации под необходимите за потискане на образуването на лед в някои области.

Затова съвременната перфузия измерва налягане, поток, температура и венозна концентрация, вместо да разчита само на обема на разтвора.

4. Термични градиенти

Голям обект се охлажда отвън навътре. Различните температури предизвикват различни степени на свиване.

Около и под температурата на стъкловидния преход материалът не може бързо да освободи натрупаните напрежения. Ако напрежението надхвърли механичната якост, могат да се образуват пукнатини.

Решението включвало контролирано охлаждане, отгряване в близост до Tg и по-бавно преминаване през областта на стъкловидния преход. Днес тези принципи са в основата на компютърно контролираното охлаждане при биостаза на човек.

1990-те и 2000-те години: смеси заменят подхода с един-единствен агент

Никой отделен криопротектант не оптимизирал всички изисквания. Изследователите все по-често комбинирали проникващи агенти, така че всеки от тях да допринася за ефекта, без да се налага достигане на прекомерна концентрация на отделния агент.

Носещите разтвори контролирали йони, pH и осмотичните условия. Непроникващите полимери влияели върху разпределението на водата в тъканта и върху състоянието на съдовете.

Синтетичните инхибитори на леда ограничавали хетерогенното зародишообразуване и растежа на ледените кристали. Те намалили зависимостта единствено от грубото повишаване на концентрацията на криопротектант.

Разтвори като VS55, а по-късно и M22, са резултат от системно инженерство: съчетание от множество агенти, инхибитори на леда и внимателно подбран състав на носещия разтвор, заедно с определени протоколи за перфузия и топлинен контрол.

Обзор от 2004 година върху витрификацията на органи описва постигнатото в намаляването на токсичността, увреждането при охлаждане, контрола на зародишообразуването и перфузията на органи.

Същественото постижение не било премахването на токсичността. Изследователите се научили да намират баланс между химичния състав, времето на експозиция и температурата.

Опитите с бъбрек на заек: важни и лесни за преекспониране

Работата с бъбреци на заек показала, че васкуларизиран орган на бозайник може да бъде натоварен със сложен витрификационен разтвор, охладен до стъкловидно състояние, затоплен обратно и трансплантиран.

В един описан случай бъбрекът функционирал като единствен бъбрек на заек за продължителен период.

Този резултат е важен, защото показал преход от микроскопични образци към функционален цял орган. Той не установил надеждна клинична процедура.

В по-късната литература се отбелязва, че дългосрочен успех при трансплантация не е постигнат възпроизводимо. Разпределението, токсичността и обичайното повърхностно затопляне продължавали да ограничават резултата.

Това е най-точната оценка: значимо доказателство за принципната възможност, но с нерешени проблеми с възпроизводимостта и мащаба.

2015 година: качеството на съхранението става видимо на синаптично ниво

Методът за криосъхранение, стабилизирано с алдехид, съчетавал химична фиксация, перфузия с криопротектант и витрификация на мозъци от заек и прасе.

Изследването от 2015 година отчело ясни мембрани, синапси, везикули, миелин и вътреклетъчни структури след затопляне и подготовка за електронна микроскопия.

Изследването показало, че при големи мозъци може да се запази отлично съхранена невронна ултраструктура след безледов цикъл на съхранение.

То не показало жизнеспособно възстановяване. Фиксацията с алдехид нарочно образува кръстосани връзки в биологичния материал и е несъвместима с обичайното възстановяване на живата функция.

Следователно експериментът дал отговор за структурното съхранение, но не и за възстановяването на жизнени функции.

По-широкият му принос бил методологически: качеството на съхранението трябва да се оценява чрез пряко изследване на запазените структури, а не само по стъкловидния вид на образеца.

2023 година: нанозатоплянето решава проблема с обратното затопляне при бъбреци на плъх

Охлаждането е само една от двете ключови части на обратимото криосъхранение. Обратното затопляне често е по-трудно.

Ако затоплянето е твърде бавно, лед може да нараства по време на девитрификацията. Ако затоплянето идва главно от повърхността, температурните градиенти могат да предизвикат напукване на органа.

Нанозатоплянето адресира и двата проблема, като железооксидни наночастици се разпределят в съдовата система и се загряват с променливо радиочестотно магнитно поле.

През 2023 година изследователи витрифицирали бъбреци на плъх, съхранили ги до 100 дни, нанозатоплили ги и ги трансплантирали.

Възстановените бъбреци осигурили жизненоважна бъбречна функция при реципиенти без собствени бъбреци през описания в изследването период на проследяване.

Постижението зависело от повече от самото затопляне. Екипът използвал по-малко токсична формулация и моделирал въвеждането на криопротектанта, за да подобри разпределението му в тъканта.

Това е повтарящ се урок в историята на витрификацията: решаването на един проблем разкрива следващия, а успешното възстановяване зависи от всички етапи на процеса.

2024 до 2026 година: по-големи физически системи и функционираща невронна тъкан

През 2024 година изследователи съобщили за физическа витрификация в мащаб на човешки орган в системи с обем от 0,5 до 3 литра, съпоставим с този на човешки орган.

Те съчетали вътрешна термометрия, отгряване, контролирано охлаждане и микро-КТ изследване. Освен това демонстрирали нанозатопляне в обеми до 2 литра.

Най-мащабните демонстрации имали предимно физичен, а не биологичен характер. Липсата на видим лед и пукнатини е необходимо условие, но не доказва биологично възстановяване на орган с размерите на човешки орган.

През 2026 година изследване в PNAS съобщило за краткосрочно функционално възстановяване на хипокампалната тъкан на възрастна мишка след витрификация и затопляне.

Изследването измерило морфология, реакция на митохондриите, невронна възбудимост, синаптична трансмисия и дълготрайна потенциация.

Изследването включвало срезове от мозък на мишка и препарати от цял мозък с ниска успеваемост, а не човешки мозък. Значението му е ограничено, но все пак съществено.

Изследването показало, че невронна тъкан от възрастен бозайник може да възстанови електрофизиологични функции след престой в стъкловидно състояние, при което молекулната подвижност е практически преустановена.

Биостазата при хора прилага тези научни постижения при по-тежки условия

Опитите за банкиране на органи започват със здрава тъкан, контролирано време и планиран достъп до съдовата система.

Процедурите по биостаза при хора започват след констатирането на законна смърт. Заболяване, топла исхемия, съсъци, отоци, транспорт и съдово заболяване могат всички да влошат доставянето на криопротектант.

Непосредствената цел е структурно съхранение с надеждата за евентуално бъдещо възстановяване, а не обратима трансплантация при сегашните възможности на медицината.

Поради тази разлика лабораторните резултати не могат да се пренасят пряко към случаи при пациенти.

Как Tomorrow.bio адаптира витрификацията за условия на терен

Tomorrow.bio извършва целотелесна криопротективна перфузия в специализирани реанимобили. Процедурата може да започне в близост до пациента, без да се изчаква транспортиране до Швейцария.

Това променя важен фактор, който химията не може да поправи: продължителността на исхемията преди перфузията.

Настоящият протокол използва разтвор на базата на VM-1, адаптиран за криопротекция на терен и последващ транспорт със сух лед.

Изследователска програма на EBF изследвала VM-1 при симулирани условия след смъртта, включително три часа топла исхемия.

В програмата били измервани коефициентът на пречупване на венозната течност, времето за перфузия, промяната в теглото, свиването на мозъка и образуването на лед, докато били тествани промени в перфузата и процедурата.

Това е практическото ограничение при случаи с хора: въпросът не е само дали идеален разтвор може да постигне витрификация, а доколко може да бъде перфузиран пациент с исхемично увреждане.

Измерването се превърна в част от процедурата

В ранните изследвания успехът на витрификацията често се оценявал по прозрачността, калориметрията, рентгеновата дифракция, преживяемостта или функцията след затопляне.

При биостаза на хора възстановяването не може да се използва като крайна оценка при сегашните условия. Затова се нуждае от неразрушителни и извадкови измерители на качеството на съхранението.

Tomorrow.bio извършва компютърна томография на всеки пациент при една и съща температура на течния азот, за да оцени разпределението на криопротектанта и да установи наличието на лед или макроскопски дефекти при стандартизирани условия.

При отделно съгласие вземането на микропроби от нервна тъкан може да подпомогне оценката чрез електронна микроскопия на мембраните, синапсите и локалната ултраструктура.

Тези методи и ограниченията им са описани в процедурите за контрол на качеството при биостаза.

Въвеждането на измервания променило самия процес на развитие. Когато даден дефект стане видим и може да бъде сравняван между отделните случаи, промените в химичния състав и протокола могат да бъдат насочени към отстраняването му.

Какво се е подобрило и какво остава нерешено

Съвременната витрификация постигна няколко неща, които ранното замразяване не можеше:

• Безледово съхранение на много клетки, ембриони и малки тъкани.
• Функционално възстановяване на витрифицирани органи от животни в определени експерименти.
• Структурно съхранение на синаптично ниво във фиксирани мозъци на бозайници.
• Компютърно контролирано охлаждане и отгряване на по-големи системи.
• Обемно затопляне чрез технологии като нанозатоплянето.
• Методи с КТ и електронна микроскопия за оценка на действителните резултати от съхранението.

Тези постижения не са довели до обратимо криосъхранение на цялото човешко тяло.

Оставащите проблеми включват посмъртна исхемия, неравномерна перфузия, токсичност на криопротектанта, ефектите на кръвно-мозъчната бариера, термичните градиенти в цялото тяло, избягването на пукнатини и безопасно равномерно затопляне.

Дори при успешно структурно съхранение биха останали бъдещите проблеми на възстановяването на жизнените функции и лечението на първопричината за смъртта.

Тези разграничения са разгледани в техническите предизвикателства пред обратимото криосъхранение.

Допълнително четиво

• Кратка история на криониката
• Как действат криопротективните агенти
• Физични и биологични аспекти на витрификацията на бъбрек
• Витрификация и нанозатопляне на трансплантирани бъбреци на плъх
• Физическа витрификация и нанозатопляне в мащаб на човешки орган