След криопротективната перфузия пациентът не се поставя направо в течен азот.
Пациентът преминава през компютърно управлявана температурна програма, която продължава няколко дни. Сензорите, разположени в тялото, показват дали различните анатомични области се охлаждат с еднаква скорост или между тях възникват опасни температурни градиенти.
С понижаването на температурата се променят и инженерните изисквания към процеса. В началото охлаждането трябва да ограничи образуването на лед. В близост до стъкловидния преход и под него точният контрол и температурната равномерност стават по-важни от скоростта на охлаждане.
Защо е необходимо контролирано охлаждане
Криопротективните вещества намаляват скоростта на охлаждане, необходима за избягване на леда. Те позволяват на богатите на вода тъкани да преминат във високовискозно стъкловидно състояние, вместо да образуват в значителна степен ледени кристали.
Съответната температура на стъкловидния преход, означавана като Tg, зависи от разтвора, концентрацията му и метода на измерване. Става дума за диапазон, а не за един универсален биологичен праг.
При разтворите, използвани за криоконсервация на хора, този диапазон обикновено е между -120°C и -135°C.
Над този диапазон прекалено бавното охлаждане може да позволи образуването и нарастването на ледени кристали. Под нея материалът се държи все повече като чупливо твърдо тяло.
Ако повърхността се охлажда много по-бързо от центъра, различните области се свиват в различна степен. Възникващото термомеханично напрежение може да предизвика пукнатини.
Това налага внимателен баланс: достатъчно бързо охлаждане преди витрификацията, последвано от контрол на температурните градиенти и скоростта на охлаждане при преминаването в стъкловидно състояние.
Вижте разликата между замразяване и витрификация за основните фазови разлики.
Кутията за охлаждане от първо поколение
Системата от първо поколение на Tomorrow.bio, наречена V1 cooling box, въвежда основната архитектура за контролирано охлаждане на цялото тяло.
Пациентът се поставя в специална изолирана камера. Компютър управлява криогенната среда в камерата, а термодвойки измерват температурата на множество места.
Контролерът следва предварително програмирана крива, вместо да прилага непрекъснато максимално охлаждане. Данните от всеки сензорен канал се записват като част от температурния профил на пациента.
Този подход се различава принципно от директното потапяне. Системата може да забави охлаждането, да задържи температурата или да промени условията в камерата според действителната температурна реакция на пациента.
Системата от второ поколение на базата на дюар
При системата от второ поколение на Tomorrow.bio контролираното охлаждане се извършва в специално конструиран дюар.
Пациентът остава в дюара, а специализиран капак интегрира охлаждащото оборудване, компютърното управление, вентилите, връзките към сензорите и изводите за термодвойките.
Термодвойки са разположени на няколко места вътре в тялото на пациента. Допълнителни сензори следят температурната среда в дюара.
Така системата следи не само зададената температура. Тя отчита и с каква скорост се променя температурата в различните измервани области на пациента.
Компютърът регулира температурния градиент в дюара и скоростта на охлаждане, за да поддържа тези показания в допустимите според протокола граници.
Голямото тяло не може да бъде идеално еднородно по температура по време на охлаждане. Практическата цел е температурните разлики да бъдат сведени до минимум, без никоя измервана област да изостава или да се охлажда опасно по-бързо от останалите.
Конструкцията на дюара също ограничава преместването на пациента между етапа на контролираното охлаждане и криогенното съхранение. Един и същ затворен обем може да осигури стабилна и равномерна среда около пациента.
Зададената температура не е температурата на пациента
Контролерът може бързо да охлади средата. Той не може веднага да доведе центъра на човешкото тяло до същата температура.
Топлината трябва да измине пътя от по-дълбоките тъкани към повърхността. Геометрията, телесният състав, разпределението на криопротектора и позицията на сензорите влияят на наблюдаваното изоставане.
Затова само един сензор в камерата не е достатъчен. Температура на средата от -130°C не означава, че всяка измервана област от тялото на пациента е достигнала -130°C.
Системата за управление трябва да отчита както абсолютната температура, така и разликата между отделните канали. Най-бавно охлаждащата се точка, най-бързо охлаждащата се точка и общият диапазон на разликите дават различна важна информация.
Калибрирането, разположението и непрекъснатостта на термодвойките също имат значение. Неправдоподобните показания или отказът на сензор трябва да се отбелязват изрично, а не да се прикриват чрез усредняване в температурната крива.
Трифазовата температурна програма на Tomorrow.bio
Настоящият протокол включва три отделни фази. Тези стойности са работни цели за конкретното оборудване и криопротективен подход, а не универсални параметри за всяка система за витрификация.
1. Бързо спускане към -130°C
В първата фаза температурата на пациента се понижава от тази на сухия лед до около -130°C толкова бързо, колкото безопасно позволява измереният температурен диапазон.
Скоростта тук има значение, защото недостатъчно защитени области могат все още да образуват лед, преди тъканта да премине в стъкловидно състояние.
Компютърът не се ориентира единствено по изминалото време. Той следи термодвойките и настройва средата за охлаждане около пациента.
2. Контролирано затопляне до -120°C
След достигане на около -130°C активното охлаждане се намалява, така че пациентът да се затопли естествено до около -120°C.
Това е фаза на отгряване. В близост до Tg криопротектираният материал запазва достатъчна молекулна подвижност, което позволява частично разсейване на натрупаните механични напрежения.
Контролираното затопляне също дава възможност температурите в по-топлите и по-студените области да се изравнят, преди материалът да премине по-дълбоко в твърдото стъкловидно състояние.
Отгряването не обръща вече настъпилите биологични увреждания. Целта му е по-скромна: намаляване на температурните градиенти и на напреженията, породени от неравномерното свиване.
3. Спускане до -196°C с около 1°C на час
От около -120°C нататък целевото спускане е с около 1°C на час, докато пациентът достигне температурата на течния азот.
Този последен интервал от 76 градуса отнема около три дни, без да се включват възможните задържания и корекции от системата за управление.
Поддържането на скорост от 1°C на час при голямо тяло с неравномерно разпределение на температурата изисква активно управление, а не просто настройване на таймер.
Контролерът трябва непрекъснато да регулира условията в дюара, така че показанията на вътрешните термодвойки да се понижават синхронно, без да възникват прекомерни температурни градиенти.
Когато една област изостава, допълнителното охлаждане на средата може да преохлади друга област. Точният контрол изисква съгласуване на данните от всички сензори, а не следване на едно-единствено показание.
Защо фазата на отгряване е научно основателна
Изследванията на мащабната витрификация очертават два основни риска: недостатъчно охлаждане над Tg и прекомерни механични напрежения около и под Tg.
Изследване от 2024 година върху витрификация в мащаба на човешки орган използва множество вътрешни сонди и заключава, че отгряването намалява температурните градиенти преди преминаването на материала в стъкловидна фаза.
Същото изследване установява, че бавното охлаждане под диапазона на отгряване помага да се предотврати повторното натрупване на големи температурни градиенти и напрежения.
Отделно термомеханично изследване установява, че отгряването в близост до Tg значително променя остатъчните напрежения и намалява зависимостта им от предходната скорост на охлаждане.
Тези изследвания подкрепят основната стратегия за управление на процеса. Те не потвърждават самостоятелно всяка конкретна зададена стойност в протокола на Tomorrow.bio за цялото тяло.
Цялите човешки тела са по-големи и по-разнородни от лабораторните разтвори или органи. Затова остават необходими преки температурни измервания и образна диагностика след охлаждането.
Какво записва компютърът
Полезният резултат не се изчерпва със съобщение „охлаждането приключи“. Най-важният резултат е пълният времеви запис от всеки температурен канал.
Записът трябва да показва скорости, задържания, обратни подеми, градиенти между сензорите, действията на контролера, аларми и всяко отклонение от планираната крива.
Тези данни стават част от оценката на качеството на криоконсервацията.
След охлаждането стандартизирана компютърна томография при температурата на течния азот може да разкрие разпределението на криопротектора, наличието на лед, едри деформации и пукнатини, които не могат да бъдат установени само от температурните данни.
Защо процесът завършва при температурата на течния азот
При нормално атмосферно налягане азотът кипи около 77,34 келвина, приблизително -195,8°C, според NIST Chemistry WebBook.
Съхранението в течен азот е пасивно. Докато в съда остава достатъчно количество течност, равновесието при кипенето поддържа стабилна криогенна среда без механично охлаждане.
Контролираното охлаждане завършва едва когато пациентът е достигнал подходящо температурно състояние за това стабилно съхранение. Съхранението не се използва като заместител на охлаждането.
Оборудването и компромисите на следващия етап са разгледани в материалите за съвременните криогенни дюари и съхранението при междинни температури.
Накратко: Tomorrow.bio използва компютърно управлявано охлаждане и вътрешни температурни сензори. Процесът включва бързо охлаждане до областта на стъкловидния преход, отпускане на термичните напрежения и последващо бавно охлаждане до -196°C.
Разгледайте този практически инструмент
Използвайте интерактивния инструмент, за да разгледате въпроса в тази статия.
Зареждане на интерактивния инструмент...
Допълнително четене