Витрификацията не беше едно единствено откритие. Тя възникна, когато изследователите решаваха поредица от различни проблеми в клетките, ембрионите, органите и, накрая, човешката биостáза.
Целта звучи просто: охлаждане на тъкани, богати на вода, до стъклообразна структура без образуване на увреждащ лед.
Реализацията не е проста. Криопротекторите могат да бъдат токсични. Внасянето им може да деформира клетките. Големите обекти се охлаждат неравномерно, натрупват напрежение и са много по-трудни за повторно затопляне.
Съвременните процедури следователно са системи, а не рецепти. Качеството им зависи от това как химията, перфузията, температурата, времето, геометрията и измерването работят заедно.
Преди витрификацията: студът причиняваше втора травма
Ранната криоконсервация в голяма степен означаваше замразяване. Охлаждането забавяше химичните процеси, но водата кристализираше в лед.
Ледът изключва солите и другите разтворени вещества в останалата течност. Клетките могат да изпитат механично разместване, екстремни концентрации на разтвори, дехидратация и увреждане на мембраните едновременно.
По-бързото охлаждане може да създаде по-малки кристали, но обикновената вода изисква изключително високи скорости, за да се превърне в стъкло без химична помощ. Това работи само за изключително тънки проби.
Историческата задача не беше просто да се достигне ниска температура. Тя беше да се достигне до нея без да се позволи на водата да се преустрои в увреждащи кристали.
1937 към 1938: първите експерименти по кинетична витрификация
Базил Люет предложи витрификацията като стратегия за биологично съхранение през 1937.
В 1938 Люет и Юджин Ходапп докладват възстановяването на подвижността на сперматозоидите на жабата след излагане на течен въздух, след дехидратация с концентриран захарен разтвор.
Оригиналният експерименторигиналният експериментзависиха от микроскопични филмчета и изключително бързо охлаждане. Това демонстрира физическа възможност, а не мащабируем протокол за органи.
Този подход сега се нарича кинетична витрификация: изпреварете кристализацията, като отнемате топлина по-бързо, отколкото ледът може да се зароди и да нарасне.
Мащабът го побеждава. Площта нараства по-бавно от обема, така че центърът на голям образец не може да следва повърхността достатъчно бързо.
1949: глицеролът променя проблема
Кристофър Полж, Одри Смит и Алън Паркс откриха през 1949, че глицеролът може да защити сперматозоидите по време на нискотемпературно съхранение.
Вашиятдоклад в Nature установи практическото значение на проникващите криопротективни агенти.
Тези молекули навлизат в клетките, свързват водата и намаляват количеството лед, образуван при дадена температура. Те също така намаляват концентрацията на увреждащите разтворители по време на замразяването.
Откритието преобрази криобиологията, защото скоростта на охлаждане вече не беше единствената променлива за контрол. Химичният състав можеше да промени фазовото поведение на водата.
То също така въведе нов проблем за оптимизация. По-голям брой криопротективни агенти потискат леда по-ефективно, но увеличават химичните и осмотичните увреждания.
1959 към 1968: повече агенти и стъпаловидно натоварване
В 1959, Джеймс Лъвлок и Маркъс Бишъп докладваха, че диметил сулфоксидът защитава няколко типа клетки срещу увреждане от замразяване.
DMSO проникваше през някои мембрани по-лесно от глицерола. Това разшири обхвата на клетките, които могат да бъдат криопротективни, и все още се използва широко в лабораторната и клиничната криоконсервация.
Джон Фарънт проучи повишаването на концентрацията на криопротективни агенти, докато температурата се понижава, като държи тъканта в концентрирана течност без да образува лед целенасочено.
Това предвиди основна характеристика на съвременните протоколи: натоварвайте криопротективни агенти на стъпала, при ниска температура, вместо да излагате топла тъкан на пълна концентрация изведнъж.
Стъпаловидното натоварване ограничава осмотичния шок. По-ниската температура намалява скоростта на много химични реакции и може да направи иначе увреждащото излагане по-поносимо.
В 1968, експериментите показаха, че червените кръвни клетки могат да достигнат температурата на течен азот без видим лед при достатъчно висока концентрация на глицерол.
Концептуалните части бяха налице. Оставаше да се открие практическа възможност за прилагането им към сложна, васкуларизирана тъкан.
1984: витрификация става стратегия за органи
Докладът в 1984„Витрификация като подход към криоконсервацията“преосмисли витрификацията като сериозен път към банкирането на органи.
Стратегията понякога се нарича равновесна витрификация. Вместо да изисква невъзможна скорост на охлаждане, използвайте достатъчно криопротективни агенти, за да направите критичната скорост на охлаждане постижима в по-голяма система.
Това преместване разкри три свързани ограничения:
- Решението трябва да устои на лед при достижими скорости на охлаждане и затопляне.
- Органът трябва да понася натоварването и разтоварването на това решение.
- Криопротективният агент трябва да достигне всяка област преди началото на охлаждането.
Една формула може да се представи отлично в епруветка и да се провали в орган поради факта, че съдовото съпротивление, дифузионното разстояние или токсичността променят резултата.
1985: живи ембриони се завръщат от стъкловидно състояние
Уилям Рал и Грегъри Фейли докладват забезледово криоконсервиране на миши ембриони в -196°C в 1985.
Това беше решаваща биологична демонстрация. Живи нуклеирани бозайни клетки можеха да оцелеят при охлаждане и повторно затопляне чрез напълно витрифицирано състояние.
Ембрионите все още са малки. Температурата и концентрацията им могат да се променят бързо и равномерно в сравнение с възрастен орган.
Резултатът потвърди метода, като по този начин направи проблема с мащаба по-очевиден.
Проблемът с мащаба се разделя на четири проблема
1. Токсичност на криопротективния агент
Концентрацията, необходима за витрификация, може да наруши протеините, мембраните и клетъчния метаболизъм. Токсичността зависи от агента, концентрацията, температурата, времето на експозиция и типа тъкан.
Това означава, че „по-малко токсичен“ не е свойство само на една молекула. Това е свойство на пълния протокол за натоварване и разтоварване.
2. Осмотичен стрес
Добавянето на концентриран разтвор извлича водата от клетките. Премахването му може да накара водата да се върне твърде бързо.
Съвременните протоколи използват стъпаловидно увеличаване на концентрацията, носителни разтвори, контрол на температурата и непроникващи разтворители, за да поддържат обема в границите на поносимост.
3. Нееднородно доставяне
Един орган не е съд с еднородна течност. Криопротективният агент пътува през съдове, преминава през капилярни стени и дифундира през тъканта.
Тромбозите, отоците, съдовите заболявания, исхемията и кръвно-мозъчната бариера могат да оставят някои области под концентрацията, необходима за потискане на леда.
Ето защо съвременнитеперфузионни измервания отчитат налягане, поток, температура и венозна концентрация, вместо да разчитат единствено на обема на разтвора.
4. Термични градиенти
Един голям обект изстива отвън навътре. Различните температури предизвикват различни скорости на свиване.
Близо и под температурата на стъкловидното превръщане материальт не може бързо да освободи напрежението. Ако напрежението надхвърли неговата механична якост, могат да се образуват пукнатини.
Решението беше контролирано охлаждане, отгряване близо до Tg и по-бавна скорост на спускане през стъкловидната област. Тези принципи днес оформяткомпютърно контролирано охлаждане на човека.
1990 и 2000: смесите заместват мисленето с единични агенти
Нито един криопротективен агент не отговаря оптимално на всички изисквания. Изследователите все повече комбинират проникващи агенти, така че всеки да може да допринесе, без да достига своята най-лоша индивидуална концентрация.
Носителите на разтвори контролират йоните, pH и осмотичните условия. Непроникващите полимери влияят върху водата в тъканите и поведението на съдовете.
Синтетичните блокери на лед целят хетерогенното зародишообразуване и растеж на леда. Те намалиха зависимостта единствено от концентрацията на криопротективни агенти.
Разтвори като VS55 и по-късно M22 представляват системно инженерство: множество агенти, блокери на лед и внимателно проектирана химия на носителя, съчетани с дефинирани протоколи за перфузия и термично въздействие.
Една2004 преглед на витрификацията на органи описва напредъка в намаляването на токсичността, студовата травма, контрола върху зародишообразуването и перфузията на органи.
Важното постижение не беше, че токсичността изчезна. Изследователите научиха как да разпределят натоварването между химията, времето и температурата.
Експерименти с бъбреци на зайци: важни и лесни за преувеличаване
Работата с бъбреци на зайци демонстрира, че васкуларизиран бозайнически орган може да бъде натоварен с комплексен витрификационен разтвор, охладен до стъкловидно състояние, повторно затоплен и трансплантиран.
Един от докладваните бъбреци поддържал заек като единствен функциониращ бъбрек за продължителен период.
Този резултат е важен, защото преодолява границата от микроскопични проби до функциониране на органа. Той не установи надеждна клинична процедура.
По-късната литература отбелязва, че дългосрочният успех на трансплантацията не е постигант възпроизводимо. Дистрибуцията, токсичността и конвенционалното повторно затопляне от повърхността останаха ограничаващи фактори.
Това е правилният епистемологичен статус: значимо доказателство за принцип с проблем на възпроизводимостта и мащаба.
2015: качеството на съхранението става видимо на синаптично ниво
Криозапазването със стабилизация на алдехиди комбинира химическа фиксация, перфузия с криопротектори и витрификация в мозъци на зайци и свине.
Проучването2015 докладва за ясни мембрани, синапси, везикули, миелин и интрацелуларни структури след повторно затопляне и подготовка за електронна микроскопия.
То демонстрира, че отличната ултраструктура на невроните може да оцелее при цикъл на съхранение без лед в големи мозъци.
То не демонстрира възстановима жизнеспособност. Алдехидната фиксация целенасочено свързва биологичния материал и е несъвместима с обичайното възстановяване на жива функция.
Експериментът следователно отговори на структурен въпрос, а не на въпроса за пълното възраждане.
По-широкото му приношение беше методологично: съхранението трябва да се оценява чрез инспекция на структурите от интерес, а не само чрез наблюдението, че пробата изглежда стъкловидна.
2023: нанозагряването решава повторното затопляне при бъбреци на плъхове
Охлаждането е само половината от обратимото криозапазване. Повторното затопляне често е по-трудно.
Ако загряването е твърде бавно, ледът може да нарасне по време на девитрификация. Ако топлината идва главно от повърхността, температурните градиенти могат да разкъсат органа.
Нанозагряването решава и двете проблеми, като разпределя железнооксидни наночастици през васкулатурата и ги загрява с променливо радиочестотно магнитно поле.
В 2023 изследователитевитрифицираха бъбреци на плъхове, съхраниха ги до 100 дни, нанозагряха ги и ги трансплантираха.
Бъбреците, които бяха възстановени, възстановиха поддържащата живота бъбречна функция при приемателите без собствени бъбреци по време на докладвания период на наблюдение.
Постижението зависи от повече от затоплянето. Екипът премина към по-малко токсична формулация и моделира натоварването с криопротектори, за да подобри концентрацията на тъканта.
Това е повтарящ се урок в историята на витрификацията: решаването на един възлов проблем разкрива следващия, а успешно възстановяване изисква цялата верига.
2024 към 2026: по-големи физически системи и функционална нервна тъкан
В 2024 изследователите докладвахафизическа витрификация в мащаб на човешки орган в системи от 0.5 до 3 литра.
Те комбинираха вътрешна термометрия, отгряване, контролирано охлаждане и инспекция с микро-КТ. Те демонстрираха също нанозатопляне в обеми до 2 литра.
Най-големите демонстрации бяха предимно физически. Избягването на видим лед и пукнатини е необходимо, но то не установява биологично възстановяване на човешки по размер орган.
В 2026, едно проучване вPNASдокладва краткосрочно функционално възстановяване на тъкан от хипокампа на възрастен мишок след витрификация и повторно затопляне.
Проучването измерваше морфология, митохондриална реактивност, невронна възбудимост, синаптична трансмисия и дълготрайна потенциация.
То включваше миши мозъчни резенчета и препарати на цели мозъци с ниска ефективност, но не човешки мозък. Значението му е по-ограничено, но все пак значително.
То показа, че възрастна бозайническа нервна тъкан може да възстанови електрофизиологични функции след като молекулната подвижност е спряла в стъкловидно състояние.
Човешката биостаза наследява науката при по-трудни условия
Експериментите с органи за банкиране започват с здрава тъкан, контролирано време и планиран достъп до кръвоносната система.
Човешката биостаза започва след правната смърт. Болестта, топлата исхемия, съсирването, отока, транспорта и съдовите заболявания могат да нарушат доставката на криопротектори.
Непосредствената цел е структурната запазеност за възможен бъдещ ремонт, а не обратима трансплантация в днешно време.
Това различие е причината, поради която лабораторните твърдения не могат да бъдат директно пренесени върху твърдения за пациенти.
Как Tomorrow.bio адаптира витрификацията за полеви условия
Tomorrow.bio премести цялостната криопротективна перфузия в специализирани линейки. Процедурата може да започне близо до пациента, вместо да се изчаква транспортирането до Швейцария.
Това променя един важен фактор, който химията не може да възстанови: количеството исхемия преди перфузията.
Настоящият протокол използва витрификационна химия на базата на VM-1, адаптирана за полева криопротекция и последващ транспорт със сух лед.
Едноизследователска програма на European Biostasis Foundation тества VM-1 при симулирани постмортални условия, включително три часа топла исхемия.
Програмата измерва рефрактивния индекс на вените, времето за перфузия, промяната в теглото, свиването на мозъка и образуването на лед, като тества промени в перфузата и процедурата.
Това е практическата граница за човешки случаи: не дали една идеална разтвор може да витрифицира, а колко добре може да бъде перфузиран реален исхемичен пациент.
Измерването стана част от процедурата
Ранните изследвания върху витрификацията често установяваха успеха чрез прозрачност, калориметрия, рентгенова дифракция, оцеляване или функция след размразяване.
Човешката биостаза не може да използва възстановяването като днешен краен резултат. Затова се нуждае от неразрушителни и извадкови измервания на качеството на консервирането.
Tomorrow.bio прави КТ сканиране на всеки пациент при една и съща температура на течния азот, за да оцени разпределението на криопротектора и да идентифицира лед или макроскопски дефекти при стандартизирани условия.
С отделно съгласие, микрообразци от нервната тъкан могат да подкрепят оценката на електронната микроскопия на мембрани, синапси и локална ултраструктура.
Тези методи и техните ограничения са описани впроцедури за проверка на качеството в биостазата.
Измерването променя самия процес на развитие. Когато едно неизправност стане видима и сравнима между случаи, промените в химията и протокола могат да бъдат насочени към нея.
Какво се е подобрило и какво все още не е решено
Съвременната витрификация постигна няколко неща, които ранното замразяване не можеше да постигне:
- Запазване без лед на много клетки, ембриони и малки тъкани.
- Функционално възстановяване на витрифицирани животински органи в дефинирани експерименти.
- Запазване на структури на нивото на синапсите в фиксирани бозайнически мозъци.
- Компютърно контролирано охлаждане и отгряване на по-големи системи.
- Обемно загряване чрез технологии като нано-загряване.
- Методи с КТ и електронна микроскопия за измерване на реалните резултати от запазването.
Не е постигнато обратимо запазване на цялото човешко тяло.
Оставащите проблеми включват исхемия след смъртта, неравномерна перфузия, токсичност на криопротекторите, ефекти върху кръвно-мозъчната бариера, температурни градиенти в цялото тяло, избягване на фрактури и безопасно равномерно загряване.
Дори успешно структурно запазване би оставило бъдещите проблеми на възстановяването, ревитализацията и лечението на първоначалната причина за смъртта.
Тези разлики се разработват втехническите предизвикателства за обратима криопрезервация.
TL;DR: Витрификацията се подобри чрез по-добри криопротектори, перфузия, контрол на леда, охлаждане, загряване и структурно измерване. Някои проблеми са решени на малки мащаби, докато обратимостта на цялото човешко тяло остава нерешена.
Разгледайте този практически инструмент
Използвайте интерактивния инструмент, за да разгледате въпроса в тази статия.
Зареждане на интерактивния инструмент...
Допълнително четене